Experimento de Meselson y Stahl

Meselson y Stahl (1957) diseñaron un experimento para tratar de averiguar la forma en la que se realiza la replicación del ADN en E. coli, es decir, la pregunta que se plantearon fue:

¿Qué modelo de replicación del ADN sigue E. coli, semiconservativo, conservativo o dispersivo?. 

Para contestar a esta pregunta, diseñaron un experimento en el que marcaban el ADN de la bacteria E. coli con Nitrógeno pesado N15, para ello hicieron crecer las bacterias durante 14 generaciones sucesivas en un medio que contenía como única fuente de Nitrógeno N15. 

Durante estas 14 generaciones el ADN de las bacterias las bacterias se había sintetizado con bases nitrogenadas con Nitrógeno pesado (N15). Posteriormente, comprobaron que podían distinguir el ADN del las bacterias que crecían en un medio normal (con N14) del ADN de las bacterias que habían crecido durante 14 generaciones en N15.

Para ello extrajeron el ADN de ambos tipos de bacterias y lo centrifugaron en un gradiente de densidad de CsCl. El resultado fue que la densidad del ADN de las bacterias que habían crecido en presencia de N15 era mayor que el ADN de las bacterias que habían crecido con N14. Una vez comprobado que eran capaces de distinguir el ADN de ambos tipos de bacterias, continuaron el experimento de la siguiente forma: Las bacterias que habían estado creciendo en Nitrógeno pesado (N15) las pasaron a un medio de cultivo que contenía N14 (Nitrógeno normal) y a distintos tiempos, media generación, una generación, dos generaciones, tres generaciones de replicación, tomaban una muestra del cultivo bacteriano, extraían el ADN y centrifugaban en gradiente de densidad de CsCl.

Cuando extraían el ADN de la bacterias que llevaban una generación creciendo en N14 y centrifugaban en CsCl, obtenían una sola banda de densidad intermedia (N14-15)entre la del ADN N14 y el ADN N15. Si extraían el ADN de las bacterias que llevaban dos generaciones creciendo en N14 y centrifugaban en gradiente de CsCl obtenían dos bandas, una correspondiente al ADN N14 y otra de densidad intermedia (N14-15) entre la del ADN N14 y el ADN N15.

 La absorbancia a 260 nm es directamente proporcional a la cantidad de ADN que contiene una banda, de manera que al medir la absorbancia de las dos bandas obtenidas en la segunda generación, obtenían que ambas contenían igual cantidad de ADN (1:1). Al extraer y centrifugar en CsCl el ADN de las bacterias que llevaban tres generaciones creciendo en N14, obtenían dos bandas, una correspondiente al ADN N14 y otra de densidad intermedia (N14-15) entre la del ADN N14 y el ADN N15. La cantidad de ADN que contenía la banda correspondiente al ADN N14 era tres veces mayor que la encontrada en la banda de densidad intermedia (N14-15), proporción (3:1). 

Los resultados obtenidos por Meselson y Stahl (1958) se ajustaban a un modelo de replicación semiconservativo. Para asegurarse, aislaron la banda de ADN de densidad intermedia (N14-15) obtenida a partir de las bacterias que llevaban una generación en N14, desnaturalizaron el ADN de la banda mediante calor para separar sus dos hélices y, manteniéndolas desnaturalizadas, centrifugaron en CsCl. Si la replicación de E. coli se ajustaba al modelo semiconservativo, una de las hélices debería estar construida con N15 (la vieja) y la otra hélice con N14 (la nueva) y, al centrifugar en gradiente de densidad esperaríamos obtener dos bandas una más densa correspondiente a la hélice construida con N15 y otra menos densa sintetizada con N14. El resultado obtenido por Meselson y Stahl (1958) fue precisamente el esperado para una replicación semiconservativa

Preguntas de clase

Cual es la diferencia entre Nitrogeno 14 y Nitrogeno 15

Una de las principales diferencias como lo expresa la lectura es su peso el N15 es mucho más pesado que el N14, eso se debe a que pose un Neutron más.